Anàlisi morfomètric de lisosomes: MARCADORS DE TRANSFORMACIÓ CEL·LULAR DEL EPITELI MAMARI

REV CHIL Obstet Ginecol 2009; 74 (2): 83-87

Treballs Originals

Anàlisi morfomètric de lisosomes: MARCADORS DE TRANSFORMACIÓ CEL·LULAR DEL EPITELI MAMARI

Ricardo Cornejo O. a

Departament de Ciències Bàsiques, Facultat de Medicina, Universitat de la Frontera, Temuco. Ajudes a Biòleg Cel·lular, PhD.

RESUM

Antecedents: Transformació cel·lular és el mecanisme resultant de la potent acció generada per onco-gens transformants sobre una cèl·lula normal, els quals amb la consegüent expressió de oncoproteïnes determinen dràstics canvis tant en la morfologia com en els volums dels components cel·lulars, generant una cèl·lula amb diferent funcionalitat. Objectiu: Precisar les modificacions que caracteritzen el mecanisme transformant en cèl·lules d’epiteli mamari transfectat amb l’oncogèn ras (HC1 Ires) en comparació amb el seu tipus cel·lular normal (HC11GM). Mètode: Es va estudiar amb microscòpia electrònica de transmissió aplicant tècniques morfomètriques a aquests tipus cel·lulars amb èmfasi en els lisosomes, quan-tificando variacions de l’organelo responsable de la digestió cel·lular. Resultats: Tots els paràmetres lisosomals avaluats en el tipus cel·lular transformat presenten diferències significatives pel que fa a la cèl·lula normal. Conclusió: Les dràstiques modificacions experimentades pels lisosomes es reflecteixen en l’adquisició de noves funcionalitats en la cèl·lula transformada.

PARAULES CLAU: Transformació cel·lular, lisosomes, morfometria.

SUMMARY

Background: Cellular transformation is the result mechanism of powerful action generated by transforming oncogene over a normal cell, which with the subseqüent oncoprotein expression leads to drastic changes in morphology as well as in cell components volumes, generating a cell with a different function. Objective: To specify the Modifications that characterizes the transforming mechanism in mammary Epithelial cells transfected with the arran oncogene comparing them with its normal cell type. Method: Transmission electronic microscopy using morphometric techniques was applied to this cell types, emphasizing lysosomes variations, trying to clarify its role in each cell type metabolism. Results: Everyone lysosomal parameters examined in Transformed cell type present significant differences regarding to the normal cells. Conclusió: The drastic changes in lysosomes reflected in the acquisition of new energy requirements and metabolism in the Transformed cell.

KEY WORDS: Cellular transformation, lysosomes, morphometry.

INTRODUCCIÓ

Les cèl·lules HC11 constitueixen una línia d’epiteli mamari normal derivada de la nissaga COMMA 1D, obtingudes de glàndula mamària de rates Balb / c en meitat de prenyat, que es disposen en contacte estret i formant un epiteli cúbic en mono-capa. Aquestes cèl·lules retenen característiques de la diferenciació normal de la glàndula i sintetitzen juny caseïna, la principal proteïna de la llet (1).

Aquestes cèl·lules mamàries normals i en etapa de proliferació reben les estimulacions de l’factor de creixement epidèrmic (EGF), agent mitogé-nic que s’uneix amb un receptor tirosina quinasa a nivell de la membrana plasmàtica fosforilando proteïnes citoplasmàtiques, etapa fonamental en el desenvolupament de la resposta mitogènica (2).

en la mesura que es realitza la introducció en les cèl·lules HC11 de vectors d’expressió de la proteïna oncogènica Ha-ras aquestes assumeixen diferents propietats donant origen a un tipus cel·lular modificat i amb característiques neoplàsiques (3,4).

en el transcurs de la transformació entre cèl·lules que només proliferen (HC11 GM) i aquelles que pateixen les variacions de components producte de l’acció oncogènica (HC11 ras), la funcionalitat lisosomal adquireix un paper fonamental i és responsable Tant o de les activitats digestives derivades dels mecanismes de fag i pinocitosi com a producte de l’procés autofágico (5). En aquest context, considerant que els lisosomes són responsables de l’procés degradatiu de substàncies derivades de l’entorn cel·lular i pròpies de l’citoplasma (6,7), va semblar important determinar des del punt de vista qualitatiu i morfològic, les variacions que aquest organelo presenta durant el mecanisme de transformació cel·lular.

MATERIAL I MÈTODE

Microscòpia electrònica de transmissió. A l’pellet que contenia les cèl·lules HC11 GM i HC11 ras, se li va addicionar solució de glutaraldehid 2%, en tampó fosfat 0,15 M, pH 7,2 i es va mantenir a temperatura ambient per 2 hores. Posteriorment va ser sotmès a un rentat en solució de 6 g de NaCI i 73 g de sacarosa, dissolts en 1 litre d’aigua destil·lada. La post-fixació es va realitzar en solució de tetròxid d’osmi 1% dissolt en la solució de rentat abans descrita durant una hora a 40s C i acetat de ura-nilo 0,5%, per 18 hores.

Després de rentat el material va ser deshidratat en concentracions creixents d’acetona (30 a 100%) i inclòs en Araldita 6005. Es van obtenir talls ultrafins d’aproximadament 70 nm de gruix, els que van ser tractats amb acetat de ura -nilo 2% durant 40 minuts i citrat de plom 0,5%, per 10 minuts. Les mostres van ser estudiades i fotografiades en un microscopi electrònic Phillips EM 400.

Mètode estereològic. A partir dels blocs per microscòpia electrònica, van ser obtinguts talls ultrafins, en els quals es micrografiaron cadascun dels tipus cel·lulars, amb un augment de 10.500 X. Per a l’avaluació de les fraccions volumètriques lisosomals, va ser sobreposat un reticle de punts, en les micrografies electròniques i es va procedir a l’amb-teo diferencial dels punts que incidien sobre els perfils d’aquests orgànuls, calculant-se la fracció volumètrica que ocupa, mitjançant la següent equació:

Per al càlcul de l’àrea lisosomal va ser utilitzat el programari Sigma Scan Pro 5.0. Amb l’objectiu de determinar diferències estadísticament significatives les dades morfomètriques van ser sotmesos a la prova de Wilcoxon per a mostres no paramètriques.

RESULTATS

Anàlisi quantitatiu. Les fraccions volumètriques corresponents als lisosomes quantificades en els tipus cel·lulars proliferatius i transformats es mostren a la Figura 1, evidenciant que hi ha una clara diferència en la taxa de mecanismes endocitósicos i autofágicos en cada cèl·lula. Encara més, estudiades, quantificades i sotmesos tots els resultats obtinguts a la prova estadística de Wilcoxon per a mostres no paramètriques, amb un 95% de confiança i un error de 5%, considerant un p = 0,42 i 0,43 i considerant que aquesta prova estableix diferències amb un valor de Z = a 2,032 i 2,023 tant per a les longituds i àrees que posseeixen els lisosomes (triades per atzar) com en el nombre de organelos avaluats en les cèl·lules HC11 GM i HC11 ras, indiquen que hi ha marcades diferències , situació evidenciada clarament a la Taules i, II i III, respectivament.

a

a

Anàlisi morfològica. Els escassos lisosomes pertanyents a la cèl·lula proliferant es caracteritzen per distribuir a l’atzar en tot el seu citoplasma (Figura 2), presentant una estructura bàsicament esfèrica i de mida petita destacant la presència de la seva estructura membranosa envoltant un lumen que pot aparèixer tant homogènia i translúcida com electrodensa (fletxes). D’altra banda, com es mostra a la Figura 3 els múltiples lisosomes trobats a la cèl·lula transformada es caracteritzen per presentar grans dimensions, disposant-se en tota la superfície citoplasmàtica, evidenciant formes variades tant circulars com ovoides i que destaca per la de presentar-se com cossos multivesiculares en l’interior apareixen restes de material producte de digestió cel·lular (fletxes).

a

a

DISCUSSIÓ

les dades morfomètriques aquí presentades descriuen que les cèl·lules en procés proliferatiu i altament indiferenciades no tenen orgànuls, situació que concorda amb el descrit en 1975 per Junqueira i Salles (8), en el sentit que han demostrat que les cèl·lules indiferenciades pràcticament no posseeixen orgànuls, incloent lisosomes, la traducció funcional en aquest cas, està representada per escassos mecanismes de endoci-tosi i autofàgia.

en aquest mateix sentit Trump i cois (9 ), ja descrivien que l’autofàgia és un mecanisme característic de les cèl·lules que segueixen el curs normal dels processos de diferenciació, abandonant les fases indiferenciades de la mera proliferació i creixement cel·lular.

d’altra banda, la transfecció d’aquestes cèl·lules mamàries mitjançant l’oncogèn ras, es tradueix en el cessament immediat de la síntesi làctia causa de el bloqueig de l’f actor de transcripció de el gen de 6 caseïna i amb la consegüent adquisició d’un fenotip neoplàsic (10). Aquesta dada és important, ja que el 1987 Fawcet (11) va descriure en epiteli mamari normal un augment en el nombre de lisosomes en mesura que sobrevé el terme de la lactació, és a dir, començant el període d’involució de la glàndula mamària, evidenciant, com en els nostres resultats, gran quantitat de lisosomes secundaris sota la forma de cossos multivesi-lars contenint porcions de organelos com reticle endoplasmàtic de grava ciment, mitocòndries o grànuls de secreció al seu interior. Aquest procés d’autofàgia tindria com a objectiu una eventual remodelació d’aquestes cèl·lules transformades.

En aquest mateix sentit, els nostres resultats mostren clarament que els lisosomes pateixen diverses modificacions amb el decorrer de l’mecanisme de transformació, i resulta evident un dràstic augment tant en el volum, número i longitud, com en les àrees de aquests orgànuls. Aquestes dades són coincidents amb el que ha informat Trump i cois (9), els qui plantegen que quan les cèl·lules normals són sotmeses a injúries sub-leta-les (tal com la transfecció amb el ras), es generen múltiples lisosomes producte d’actius processos autofágicos .

visualitzant les variacions experimentades pels lisosomes amb l’esdevenir de l’mecanisme de transformació, resulta obvi que correspon a el reflex d’alteracions en el metabolisme de les cèl·lules i per tant, es pot concloure que l’avaluació d’aquest organelo, quantificats en cèl·lules transformades, expressen notables increments i per tant, aquests dràstics augments en tots els paràmetres quantificats, determinen un sòlid marcador de el procés de transformació cel·lular en aquest epiteli mamari (12).

BIBLIOGRAFIA

1. Mart BM, Jeschke M, Graus-Porta D, Taverna D, Hofer P, Groner B, et al. Neu differentiation factor he-regulin modulates growth and differentiation of HC11 mammary Epithelial cells. Mol Endocrinol 1995; 9: 14-23.

2. Normanno N, Ciardello F. EGF related peptides in the pathophysiology of the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplàsia 1997; 2: 143-51.

3. Egan S, Wright J, Greenberg A. Molecular determinants of metastatic transformation. Environ Health Perspect 1991; 93: 91-5.

4. Hynes N, Taverna D, Caitriona M, Stiefel O, Taverna D, Ball R, et al. The v-raf and Ha-rasoncogenes Inhibit transcription from the beta-casein gene promoter by Suppression of a mammary gland specific transcription factor. In: Li J. Hormonal Carcinogenesis. Berlin, Springer Verlag, 1993; 164-71.

5. Darnell J, Lodish et H, Baltimore D, Molecular Cell Biology. Editorial Scientific American Books, New York, 1990; 559-669.

6. Junqueira L, Carneiro J. Biologia Cel·lular i Molecular. Editorial McGraw-Hill Interamericana, Sao Paulo, 1997; 99-101.

7. Lodish et H, Berk A, Zipursky S, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. Biologia Cel·lular i Molecular. Editorial Mèdica Panamericana, Madrid Espanya, 2003; 622-31.

8. Junqueira L, Salles L. Ultrastrutura i fungao cel·lular. Editorial Guanabara-Koogan. Rio de Janeiro, 1975; 20-102.

9. Trump B, Berezesky I, Collan I, Kahng M, Mergner W. ReZcent studies on the pathophysiology of ISCHE-mic cell injury. Beitr Pathol 1976; 158: 363-88.

10. Happ B, Hynes N, Groner B. Ha-ras and v-raf oncogens, but not int-2 and c-myc, INTERFERE with the lactogenic hormone dependent activation of the mammary gland specific transcription factor. Cell Growth differ 1993; 4: 9-15.

11. Fawcett D. Tractat d’Histologia. Editorial Interameri-cabell blanc-McGraw-Hill, 1987; 240-36.

12. Celia N, Cornejo R, Montes G, Hynes N, Chammas R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novell differentiation marker for HC11 ratolí mammary Epithelial cells. Differentiation 1996; 61: 113-20.

Deixa un comentari

L'adreça electrònica no es publicarà. Els camps necessaris estan marcats amb *